|
|
Vybrané mikrobiální procesy v bioreaktoru
Klinková, Lucie ; doc.RNDr.Petr Zbořil, CSc. (oponent) ; doc.Ing.Martin Mandl, CSc. (vedoucí práce)
Tato diplomová práce je zaměřena na monitorování průběhu mikrobiálních kultur v bioreaktoru a hodnocení bioprocesu. Je rozdělena do dvou částí. První část se zabývá produkcí mutantní formy proteinu cryptogeinu kvasinkou Pichia pastoris. Teoretická část shrnuje poznatky o kvasince P. pastoris a její expresi. Dále se zabývá cryptogeinem, který vyvolává obranné reakce u rostlin. V Experimentální části byla vyprodukována mutantní forma cryptogeinu X24, u které byla stanovena koncentrace jednotlivých frakcí a schopnost přenosu sterolů. Druhá část této práce je zaměřena na aerobní a anaerobní oxidaci síry bakterií Acidithiobacillus ferrooxidans. V teoretické části jsou shrnuty poznatky o bakterii A. ferrooxidans, jejím metabolismu a významu ATP pro metabolismus. V experimentální části byl tento bioproces monitorován pomocí pH, koncentrace biomasy, rychlosti oxidace síry a buněčného obsahu ATP.
|
|
|
Analýza aktivního místa rutinosidasy z Aspergillus niger a jeho mutageneze
Šidáková, Anna ; Bojarová, Pavla (vedoucí práce) ; Palyzová, Andrea (oponent)
Rutinosidasy (α-L-rhamnosyl-β-D-glukosidasy) z Aspergillus niger (AnRut) jsou glykosidasy (EC 3.2.1) katalyzující hydrolýzu glykosidové vazby mezi aglykonem a disacharidovým zbytkem rutinosou. Duální substrátová specifita této skupiny enzymů popisuje paralelní aktivitu k substrátům rutinu (nesoucímu disacharidový zbytek rutinosyl) a isokvercitrinu (nesoucímu glukosyl). Aktivní místo AnRut je komplexnější než u ostatních glykosidas a je tvořeno katalytickými aminokyselinami Glu210 a Glu319 v aktivním místě a postranním tunelem - tato netradiční struktura s rozdílnými interakcemi v tunelu a aktivním místě je pravděpodobně důvodem výjimečné substrátové specifity enzymu. Bodovou či vícenásobnou mutací enzymu můžeme modifikovat jeho primární i sekundární strukturu, a tím způsobit i výrazný posun substrátové specifity. Hlavním cílem této práce je analýza tří rozdílných mutantních variant rutinosidasy AnRut, jejich produkce, purifikace a studie vlivu mutací v těchto variantách na substrátovou specifitu enzymů. Všechny varianty byly navrženy na základě molekulárního modelování. Substrátová specifita byla mj. stanovena reakcemi mutantních variant s dosud neprostudovanými substráty. Pomocí HPLC byla také stanovena afinita jednotlivých variant k přirozeným substrátům rutinu a isokvercitrinu. Klíčová slova...
|
|
|
Mutantní glykosidasy s vysokou substrátovou specifitou a jejich analýza
Nekvasilová, Pavlína ; Bojarová, Pavla (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent)
β-N-Acetylhexosaminidasy (EC 3.2.1.52, GH20) jsou retenující exo-glykosidasy, které in vivo odštěpují jak β-N-acetylglukosamin (GlcNAc), tak β-N-acetylgalaktosamin (GalNAc) z glykosylovaných struktur. Za vhodných reakčních podmínek jsou tyto enzymy schopné glykosidovou vazbu i syntetizovat. Cílenou mutagenezí v aktivním centru enzymu lze např. dosáhnout změny substrátové specifity nebo potlačit hydrolytickou aktivitu enzymu ve prospěch syntézy. Předkládaná práce se zabývá třemi mutantními β-N-acetylhexosaminidasami z Talaromyces flavus. V jejich aktivním centru byla provedena záměna aminokyselinových zbytků, které jsou zodpovědné za vazbu hydroxylu na C-4 substrátu (Arg218, Glu546), za aminokyseliny navržené na základě molekulárního modelování. Byl studován vliv vnesených jednobodových mutací na substrátovou specifitu připravených enzymů. Mutantní β-N-acetylhexosaminidasy byly heterologně exprimovány v Pichia pastoris a charakterizovány. Dále byly provedeny transglykosylační reakce s těmito enzymy. Připravené sacharidové produkty byly charakterizovány pomocí NMR.
|
|
| |
|
|
Studium receptorů NKR-P1A a NKR-P1B exprimovaných v eukaryotických organismech
Ivanova, Lyubina ; Bezouška, Karel (vedoucí práce) ; Rychlovský, Petr (oponent)
Důležitou součástí imunitního systému jsou NK (natural killer) buňky, které mají schopnost identifikovat antigeny a cizorodé látky přítomné v organismu prostřednictvím molekulově rozmanitých receptorů. Mezi receptory přirozených zabíječů patří lektinové proteiny NKR-P1A a NKR-P1B, jejichž ligandy jsou převážně terminální oligosacharidy glykoproteinů na cílových (např. nádorových) buňkách. Po interakci sacharidových struktur na povrchu antigenů s jejich vazebnými partnery na NK receptorech jsou spouštěny výkonné mechanismy NK buněk, které příslušné cílové buňky zabíjí. V současné době jsou poznatky v oblasti NK buněk, jejich receptorů a interakcích s ligandy značně využívány při léčbě nádorů, virových a autoimunitních onemocnění. Exprese heterologních proteinů v eukaryotických organismech s sebou přináší mnoho výhod. Methylotrofní kvasinka Pichia pastoris je, na rozdíl od prokaryotických organismů, schopná post-translačních modifikací, jejichž výsledkem jsou biologicky aktivní molekuly exprimovaných proteinů. Expresní systém P. pastoris má obvykle vysokou úroveň exprese proteinů a je obecně pokládán za rychlejší, snažší a levnější ve srovnání s jinými eukaryotními systémy. V této diplomové práci jsou předkládány výsledky přípravy expresního vektoru, vhodného pro expresi potkaních proteinů NKR-P1A a...
|
|
|
Integrated development of a bioprocess: From the soil enzyme to the yeast production platform
Borčinová, Martina ; Kyslík, Pavel (vedoucí práce) ; Uhlík, Ondřej (oponent) ; Hasal, Pavel (oponent)
V zájmu udržitelné budoucnosti se stupňuje tlak na zvýšení podílu biotechnologií a biomateriálů na trhu. Mikrobiální biotechnologie mají potenciál a schopnost na mnoha úrovních podstatně přispět k tomuto celosvětovému úsilí o dosažení udržitelnosti. Vývoj a využití mikrobiálních technologií je však komplexní proces zahrnující řadu kroků, včetně objevování nových technologií a vývoje průmyslově realizovatelných výrobních systémů. V předložené práci byly řešeny jednotlivé kroky vývoje mikrobiální biotechnologie. V první části studie byla využita řada metodických přístupů ke studiu vlivu antropogenní aktivity (tj. desetiletí trvající produkce penicilinu G) na strukturu půdních mikrobiálních společenstev. Kultivovatelné i nekultivovatelné frakce těchto populací byly zároveň podrobeny funkčnímu screeningu za účelem odhalení biotechnologického potenciálu mikroorganismů ve smyslu produkce enzymů podílejících se na biotrasformaci beta-laktamových antibiotik: penicilin G acylázy (PGA) a esterázy alfa-aminokyselin (AEH). Naše výsledky ukázaly, že společenstva zasažených půd ukrývají mikrobiální komunitu se zvýšenou biodiverzitou a druhovou bohatostí. Na úrovni složení se však tyto komunity významně liší od kontrolních vzorků, co je důkazem zásadního dopadu průmyslové činnosti na tato společenstva. Následné...
|
|
| |
|
|
Mutantní glykosidasy s vysokou substrátovou specifitou a jejich analýza
Nekvasilová, Pavlína ; Bojarová, Pavla (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent)
β-N-Acetylhexosaminidasy (EC 3.2.1.52, GH20) jsou retenující exo-glykosidasy, které in vivo odštěpují jak β-N-acetylglukosamin (GlcNAc), tak β-N-acetylgalaktosamin (GalNAc) z glykosylovaných struktur. Za vhodných reakčních podmínek jsou tyto enzymy schopné glykosidovou vazbu i syntetizovat. Cílenou mutagenezí v aktivním centru enzymu lze např. dosáhnout změny substrátové specifity nebo potlačit hydrolytickou aktivitu enzymu ve prospěch syntézy. Předkládaná práce se zabývá třemi mutantními β-N-acetylhexosaminidasami z Talaromyces flavus. V jejich aktivním centru byla provedena záměna aminokyselinových zbytků, které jsou zodpovědné za vazbu hydroxylu na C-4 substrátu (Arg218, Glu546), za aminokyseliny navržené na základě molekulárního modelování. Byl studován vliv vnesených jednobodových mutací na substrátovou specifitu připravených enzymů. Mutantní β-N-acetylhexosaminidasy byly heterologně exprimovány v Pichia pastoris a charakterizovány. Dále byly provedeny transglykosylační reakce s těmito enzymy. Připravené sacharidové produkty byly charakterizovány pomocí NMR.
|
|
|
Výskyt β-rutinosidasy v eurokaryotických mikroorganismech
Adamcová, Kateřina ; Weignerová, Lenka (vedoucí práce) ; Králová, Blanka (oponent)
Rutinosidy jsou velmi běžné glykosidické prekurzory aromatických látek. Navázané glykosidy ovlivňují aroma vín, chuť džusů atd, hydrolýzou glykosidické vazby je možno zvýšit aroma některých produktů. Jedním z enzymů schopných této hydrolýzy je i β-rutinosidasa produkovaná extracelulárně kmenem Aspergillus niger. Purifikovaná β rutinosidasa byla částečně sekvenována (MALDI-TOF/TOF), výsledek analýzy byl porovnán se sekvencemi v databázích (BLAST). Inzert kódující β-rutinosidasu byl ligován do expresního vektoru pPICZα A. Jako expresní systém byl použit kmen Pichia pastoris KM71H. Bylo zjištěno, že gen pro β rutinosidasu obsahuje 1137 bp kódující protein o 379 aminokyselinách. Elektroforézou v polyakrylamidovém gelu s dodecylsíranem sodným byla zjištěna molekulová hmotnost enzymu 60 kDa, deglykosylovaná froma 45 kDa. pH optimum enzymu bylo stanoveno jako 3,0 a teplotní optimum při teplotě 50 řC. Substrátem pro stanovení enzymové aktivity byl p nitrofenyl β rutinosid. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
|
|
|
Studium receptorů NKR-P1A a NKR-P1B exprimovaných v eukaryotických organismech
Ivanova, Lyubina ; Rychlovský, Petr (oponent) ; Bezouška, Karel (vedoucí práce)
Důležitou součástí imunitního systému jsou NK (natural killer) buňky, které mají schopnost identifikovat antigeny a cizorodé látky přítomné v organismu prostřednictvím molekulově rozmanitých receptorů. Mezi receptory přirozených zabíječů patří lektinové proteiny NKR-P1A a NKR-P1B, jejichž ligandy jsou převážně terminální oligosacharidy glykoproteinů na cílových (např. nádorových) buňkách. Po interakci sacharidových struktur na povrchu antigenů s jejich vazebnými partnery na NK receptorech jsou spouštěny výkonné mechanismy NK buněk, které příslušné cílové buňky zabíjí. V současné době jsou poznatky v oblasti NK buněk, jejich receptorů a interakcích s ligandy značně využívány při léčbě nádorů, virových a autoimunitních onemocnění. Exprese heterologních proteinů v eukaryotických organismech s sebou přináší mnoho výhod. Methylotrofní kvasinka Pichia pastoris je, na rozdíl od prokaryotických organismů, schopná post-translačních modifikací, jejichž výsledkem jsou biologicky aktivní molekuly exprimovaných proteinů. Expresní systém P. pastoris má obvykle vysokou úroveň exprese proteinů a je obecně pokládán za rychlejší, snažší a levnější ve srovnání s jinými eukaryotními systémy. V této diplomové práci jsou předkládány výsledky přípravy expresního vektoru, vhodného pro expresi potkaních proteinů NKR-P1A a...
|
host ::
RSS.